Avec une technique plus rapide, moins chère et plus précise, les auteurs disent qu'il est «à la course» vers de nouvelles thérapies cellulaires
Dans une réalisation qui a des implications significatives pour la recherche, la médecine et l'industrie, les scientifiques de l'UC San Francisco ont génétiquement reprogrammé les cellules immunitaires humaines connues sous le nom de cellules T sans utiliser de virus pour insérer l'ADN. Les chercheurs espèrent que leur technique – une approche rapide, polyvalente et économique utilisant la technologie d'édition de gènes CRISPR – sera largement adoptée dans le domaine émergent de la thérapie cellulaire, accélérant le développement de traitements nouveaux et plus sûrs pour le cancer, l'auto-immunité et d'autres maladies, y compris les maladies héréditaires rares.
La nouvelle méthode, décrite dans le numéro du 11 juillet 2018 de Natureoffre un système robuste de "couper-coller" moléculaire pour réécrire les séquences du génome dans les cellules T humaines. Il repose sur l'électroporation, un processus dans lequel un champ électrique est appliqué aux cellules pour rendre leurs membranes temporairement plus perméables. Après avoir expérimenté des milliers de variables au cours d'une année, les chercheurs de l'UCSF ont découvert que lorsque certaines quantités de cellules T, ADN et les «ciseaux» CRISPR sont mélangés ensemble, puis exposés à un champ électrique approprié, les cellules T prennent dans ces éléments et d'intégrer des séquences génétiques spécifiques précisément sur le site d'une coupe programmée CRISPR dans le génome.
"C'est une méthode rapide et flexible qui peut être utilisée pour altérer, améliorer et reprogrammer les lymphocytes T afin de leur donner la spécificité que nous voulons pour détruire le cancer, reconnaître les infections ou réduire la réponse immunitaire excessive. vu dans la maladie auto-immune », a déclaré Alex Marson UCSFMD, PhD, professeur agrégé de microbiologie et d'immunologie, un membre du UCSF Helen Diller Family Comprehensive Cancer Centeret auteur principal de la nouvelle étude. "Maintenant, nous sommes hors des courses sur tous ces fronts."
Mais tout aussi important que la rapidité et la facilité d'utilisation de cette nouvelle technique, dit Marson, également directeur scientifique de la biomédecine à l'Institut de génomique innovante, cette approche permet d'insérer des étendues substantielles d'ADN dans les lymphocytes T , qui peut doter les cellules de nouvelles propriétés puissantes. Les membres du laboratoire de Marson ont eu quelques succès en utilisant l'électroporation et CRISPR pour insérer des fragments de matériel génétique dans les cellules T, mais jusqu'à présent, de nombreuses tentatives de nombreux chercheurs de placer de longues séquences d'ADN dans les lymphocytes T mourir, conduisant le plus à croire que de grandes séquences d'ADN sont excessivement toxiques pour les cellules T.
Pour démontrer la polyvalence et la puissance de la nouvelle méthode, les chercheurs l'ont utilisée pour réparer une mutation génétique causant des maladies chez les enfants atteints d'une forme génétique rare d'auto-immunité, et ont également créé des cellules T personnalisées pour rechercher et tuer cellules de mélanome humain.
Les virus provoquent des infections en injectant leur propre matériel génétique à travers les membranes cellulaires. Depuis les années 1970, les scientifiques exploitent cette capacité, dépouillant les virus de leurs caractéristiques infectieuses et utilisant les «vecteurs viraux» pour transporter l'ADN dans les cellules. thérapie génique, et dans un exemple récent très médiatisé, pour créer les cellules CAR-T utilisées dans l'immunothérapie du cancer.
Les cellules T manipulées avec des virus sont maintenant approuvées par la Food and Drug Administration des Etats-Unis pour lutter contre certains types de leucémie et de lymphome. Mais la création de vecteurs viraux est un processus minutieux et coûteux, et une pénurie de vecteurs de qualité clinique a conduit à un goulot d'étranglement dans la fabrication des thérapies géniques et des thérapies cellulaires. Même lorsqu'ils sont disponibles, les vecteurs viraux sont loin d'être idéaux, car ils insèrent des gènes au hasard dans les génomes cellulaires, ce qui peut endommager les gènes sains existants ou laisser les gènes nouvellement introduits par les mécanismes régulateurs qui assurent le fonctionnement normal des cellules. Ces limitations, qui pourraient potentiellement conduire à des effets secondaires graves, ont été source de préoccupation à la fois dans la thérapie génique et les thérapies cellulaires telles que l'immunothérapie à base de CAR-T.
"Il y a eu trente ans de travail pour essayer d'obtenir de nouveaux gènes dans les lymphocytes T", explique Theo Rothun étudiant qui poursuit des études doctorales et doctorales dans le cadre du programme de formation de scientifiques médicaux de l'UCSF. conçu et dirigé la nouvelle étude dans le laboratoire de Marson. "Maintenant, il ne devrait plus être nécessaire d'avoir six ou sept personnes dans un laboratoire travaillant avec des virus uniquement pour l'ingénierie des cellules T, et si nous commençons à voir des centaines de laboratoires d'ingénierie ces cellules au lieu de seulement quelques des séquences d'ADN complexes, nous allons essayer tellement plus de possibilités que cela accélérera de manière significative le développement des futures générations de thérapie cellulaire. "
Après presque une année d'essai et d'erreur, Roth a déterminé les rapports entre les populations de lymphocytes T, la quantité d'ADN et l'abondance de CRISPR qui, combinés avec un champ électrique fourni avec les paramètres appropriés, se traduiraient par édition précise des génomes des cellules T.
Pour valider ces résultats, Roth a dirigé CRISPR pour marquer un tableau de différentes protéines T avec protéine fluorescente verte (GFP), et le résultat était très spécifique, avec de très faibles niveaux d'effets "hors cible": chaque structure sous-cellulaire Les gabarits CRISPR-Cas9 de Roth avaient été conçus pour marquer avec le GFP – et aucun autre vert brillant au microscope.
Puis, dans des expériences complémentaires conçues pour prouver la promesse thérapeutique de la nouvelle technique, Roth, Marson et ses collègues ont montré comment il pourrait potentiellement être utilisé pour mobiliser les cellules T contre une maladie auto-immune ou un cancer .
Dans le premier exemple, Roth et ses collègues utilisaient des lymphocytes T fournis au laboratoire Marson par Kevan Herold, MD, de l'école de médecine de Yale. Les cellules provenaient de trois frères et sœurs atteints d'une maladie auto-immune rare et sévère jusqu'alors résistante au traitement. Le séquençage génomique avait montré que les cellules T chez ces enfants portaient des mutations dans un gène appelé IL2RA. Ce gène porte des instructions pour un récepteur de surface cellulaire essentiel pour le développement de cellules T régulatrices, ou Tregs, qui contrôlent les autres cellules immunitaires et empêchent l'auto-immunité.
UCSF Medical Center et UCSF Benioff hôpitaux pour enfants en San Francisco et Oakland ] – ainsi que l'hôpital et les cliniques psychiatriques de Langley Porter, les médecins d'enfants de l'UCSF Benioff et la pratique de la faculté de l'UCSF. UCSF Health a des affiliations avec des hôpitaux et des organismes de santé dans toute la région de la baie. Faculté UCSF fournissent également tous les soins médicaux à l'hôpital général public Zuckerberg San Francisco et Trauma Center, et le centre médical SF VA.
